2 ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИ�

2 ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ


Выращивание микроорганизмов на питательных средах называют культивированием (от лат. cultus – выращивание), а развившиеся в результате микроорганизмы – культурой. При развитии в жидкой среде культуры образуют суспензию, осадок или плёнку, а при развитии на плотной среде – колонии. Культура может быть чистой – содержать потомство клетки только одного вида и накопительной – состоять преимущественно из клеток одного вида микроорганизмов.

Внесение клеток микроорганизмов (посевного материала – инокулята) в стерильную питательную среду для получения чистой или накопительной культуры называют посевом. Перенесение уже выращенных клеток из одной среды в другую (стерильную) называют пересевом, или пассированием.

Обычно микроорганизмы выращивают при определенной постоянной температуре в термостатах (деревянных или металлических шкафах) или термостатных комнатах. В тех и других постоянная температура поддерживается с помощью терморегуляторов.

Культивирование при определенной температуре называется инкубацией, или инкубированием.

Выращивают микроорганизмы в стеклянной посуде: пробирках, колбах или чашках Петри. Для этого стеклянную посуду, не бывшую в употреблении, очищают от щёлочи кипячением в растворе, содержащем бихромат калия K2Cr2O7 (6 %) или концентрированную серную кислоту Н2SO4 (6 %).

В пробирках микроорганизмы культивируют как в жидких, так и на плотных средах. Жидкой средой для аэробных культур заполняют обычно 1/3 пробирки, для анаэробных 2/3. Если плотная среда в пробирках предназначена для последующего выращивания микроорганизмов, при подготовке к стерилизации её наливают на 1/3…1/4 объёма пробирок.

После стерилизации пробирки с ещё не застывшей средой раскладывают на ровной поверхности стола в наклонном (под небольшим углом) положении для получения скошенной поверхности агара. Это так называемые косяки – косые или скошенные среды.

Плотная среда, застывшая при вертикальном положении пробирки, называется столбиком. Столбики питательной среды, занимающей от 1/3 до 1/2 объёма пробирки, используют для посева культуры уколом. Столбики питательной среды, занимающие 2/3 объёма пробирки, после стерилизации применяют для заливки стерильных чашек Петри, предназначенных для микробиологических посевов.

Пробирки со средами и культурами во время работы устанавливают в штативы; пробирки со средами, подготовленными к стерилизации, помещают в проволочные корзины или металлические ведра с отверстиями; пробирки с культурами при инкубации или хранении – в картонные коробки.

При культивировании микроорганизмов в колбах используют только жидкие питательные среды. Для аэробных микроорганизмов среду наливают тонким слоем (например, 30 мл в колбы Эрленмейера на 100 мл), для анаэробных микроорганизмов колбу заполняют на 2/3 объёма.

В чашках Петри микроорганизмы культивируют лишь на плотных средах. Высота этой посуды – около 1,5 см, диаметр – от 8 до
10 см, причём диаметр верхней чашки (она служит крышкой) несколько больше диаметра нижней.


2.1 Техника посева и пересева культур микроорганизмов


Посев (и пересев) микроорганизмов проводят при соблюдении определенных правил стерильности, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую среду исследуемыми культурами микроорганизмов.

2.1.1 Посев на плотные среды в чашки Петри

Посев в чашки Петри проводится поверхностным и глубинным способами.

2.1.1.1 Поверхностный способ посева

Стерильную твердую питательную среду расплавляют на водяной бане в колбе и охлаждают до температуры 50°С.

Вынимают чашки Петри из бумаги, в которой они стерилизовались, и ставят их на ровную горизонтальную поверхность.

Берут колбу с охлажденной до температуры 50°С питательной средой, вынимают ватную пробку, обжигают на пламени горелки края пробирки и держат ее в наклонном положении.

Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой, а правой рукой наливают среду на дно чашки Петри, заполняя всю ее поверхность (рисунок 1).




Рисунок 1 – Заливка чашки Петри агаром


Оставляют чашку Петри на столе до полного застывания среды, затем ставят в термостат на 15…20 мин для подсушивания.

Посев на чашки с агаром производят штрихом при помощи петли либо втиранием стеклянным или металлическим шпателем.

При посеве петлёй ею захватывают небольшое количество инокулята и легко проводят по поверхности агара, нанося ряд параллельных линий или волнообразную черту (посев штрихом).

При посеве шпателем его вынимают из бумаги и берут в правую руку. Приоткрывают крышку чашки Петри левой рукой и вносят в нее шпатель.

Размазывают каплю посевного материала (предварительно внесенную пипеткой или бактериологической петлёй) шпателем вращательными движениями по поверхности агаровой пластинки (рису-
нок 2). Надавливать шпателем на твердую среду не следует, так как можно ее повредить.





Рисунок 2 – Посев шпателем


2.1.1.2 Глубинный способ посева

Приоткрывают стерильную чашку Петри и помещают петлей или пипеткой каплю посевного материала на дно чашки.

Расплавляют агаризованную питательную среду в пробирке или колбе и охлаждают ее до температуры 45°С.

Обжигают края пробирки или колбы в пламени горелки и выливают среду в чашку Петри с внесенным посевным материалом, соблюдая правила стерильной работы.

Распределяют равномерно посевной материал в питательной среде, для чего осторожно круговыми движениями перемещают чашку Петри по поверхности стола.

Оставляют чашку Петри на столе до полного застывания среды.

Делают на чашке Петри надпись (число, название микроорганизма). Все посевы, выполненные описанными способами, помещают в термостат для выращивания микроорганизмов при температуре, благоприятной для их роста.

2.1.2 Посев уколом в столбик агара или желатина

Пробирку с агаром или желатином держат дном кверху. Материал, подлежащий посеву, берут платиновой иглой, которую отвесно вка-лывают в поверхность агара или желатина и продвигают по оси про-
бирки до самого дна. Иглу затем извлекают, обжигают и закрывают пробирку пробкой (рисунок 3).





Рисунок 3 – Посев уколом


2.1.3 Пересев из пробирки в пробирку

2.1.3.1 Пересев на скошенный агар

Зажигают горелку. Пересевы проводят над пламенем горелки, чтобы теплый воздух препятствовал осаждению микроорганизмов из окружающего воздуха и отчасти их уничтожал (рисунок 4).




а, е – стерилизация петли; б – стерилизация краев пробирки;

в, г – взятие и посев материала; д – закрывание пробирок пробками


Рисунок 4 – Пересев микроорганизмов из пробирки в пробирку


Берут в правую руку бактериологическую петлю, с помощью которой осуществляют пересев (петлю держат как карандаш).

Стерилизуют бактериологическую петлю в пламени горелки, прокаливая проволоку докрасна, и одновременно обжигают примыкающую к петле часть держателя, который будет вводиться в пробирку с культурой микроорганизмов. При прокаливании петлю держат в пламени почти вертикально, чтобы вся проволока была раскалена.

Обе пробирки, т.е. ту, из которой производится пересев, и ту, которая подлежит засеву, берут вместе и держат между большим и указательным и средним пальцами левой руки. Причем пробирку со стерильной средой размещают дальше от себя, а с культурой микроорганизмов ближе к себе.

Не выпуская бактериологической петли из правой руки, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают наружные концы ватных пробок к ладони и вынимают пробки из пробирок. Класть пробки на стол нельзя.

Слегка обжигают в пламени горелки края открытых пробирок.

Вводят в пробирку с культурой микроорганизмов петлю. Чтобы не повредить клетки микроорганизмов, петлю вначале охлаждают, прикасаясь к внутренней поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от клеток микроорганизмов, и только после этого отбирают небольшое количество микробной массы.

Вынимают петлю и вводят ее в пробирку со стерильной питательной средой, избегая прикосновения со стенками пробирки.

Проводят петлей от дна вверх зигзагообразную или прямую
черту-штрих, слегка касаясь поверхности агара.

Обжигают ватные пробки и края пробирок одновременно в пламени и закрывают обе пробирки.

Обжигают петлю в пламени горелки.

2.1.3.2 Пересев культур микроорганизмов в жидкую среду

Из стерильной бумаги вынимают градуированную стерильную пипетку за верхний конец, берут пипетку средним и большим пальцами правой руки, не касаясь поверхности той части пипетки, которая будет вводиться в сосуд с жидкой средой.

Берут в левую руку пробирку (или колбу) с культурой микроорганизмов, выращенной в жидкой среде, и держат ее в вертикальном положении, чтобы не замочить пробку.

Открывают пробку, соблюдая все правила стерильности, описанные выше, и вводят пипетку в пробирку.

Набирают в пипетку суспензию микроорганизмов, закрывают пробкой пробирку (или колбу), вносят определенное количество суспензии в свежую стерильную питательную среду, соблюдая уже описанные правила предосторожности.

Пипетку помещают в сосуд с дезинфицирующим раствором (0,5…3%-ным водным раствором хлорамина или 3…5%-ным водным раствором фенола), не касаясь ею окружающих предметов.

Если пересев производят с помощью бактериологической петли, то материал, внесенный в жидкую питательную среду для посева, растирают на стенке пробирки ближе к жидкости и взбалтывают в ней.


2.2 Хранение микроорганизмов


При длительном хранении в лабораторных условиях могут измениться отдельные физиолого-биохимические или морфологические особенности микроорганизмов. Чтобы избежать этого, необходимо хранить культуру в жизнеспособном состоянии.

Традиционный метод хранения – пассирование (субкультивирование), то есть пересев на свежие питательные среды с временными интервалами в зависимости от вида микроорганизма, среды и условий хранения. Одни виды микроорганизмов требуют частых пересевов, другие можно не пересевать более месяца. В процессе такого хранения нельзя допускать пересыхания среды. Для этого пробирки с культурами рекомендуют обертывать бумагой или плёнкой и хранить в условиях, когда процессы жизнедеятельности заторможены, например в холодильнике при температуре от 5С до 8С.

Существует ряд других способов хранения культур: под слоем стерильного вазелинового масла; в ампулах с жидким азотом; в лиофилизированном состоянии, то есть высушенными из замороженного состояния. Спорообразующие бактерии могут храниться годами в стерильной сухой почве или соответствующей среде.


3 УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ


Для роста микроорганизмов существенное значение имеют не только состав питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы.


3.1 Активная кислотность среды


Активная кислотность (рН) среды имеет решающее значение для роста многих микроорганизмов. Большинство бактерий лучше всего растет при значении рН, близком к 7,0, микроскопические грибы, напротив, предпочитают слабокислые среды, поэтому в приготовленных средах всегда следует определять значение рН. Измеряют значение рН электрометрическим методом на потенциометре. В лабораторной практике удобно использовать различные жидкие или бумажные индикаторы.



Широко применяется, например, жидкий двуцветный индикатор бром-тимоловый синий (бромтимолблау). Его цвет изменяется от желтого к синему при сдвиге значения рН от 6,0 до 7,6. При величине рН 7,3 индикатор имеет сине-зеленую окраску.

В случае необходимости показатель рН среды доводят до нужного значения растворами кислот (НС1, H2SО4), щелочей (NaOH, КОН) или солей, имеющих щелочную реакцию (Na2CО3, NaHCО3). Для корректировки значения рН целесообразно иметь стерильные растворы разной концентрации.

Значение рН сред может измениться в процессе стерилизации, поэтому после стерилизации его следует проверить и, если требуется, довести до нужного с помощью стерильных растворов кислоты или щелочи. Активная кислотность питательной среды, благоприятная для начала роста микроорганизмов, часто меняется в процессе их культивирования. Эти изменения могут быть результатом образования продуктов метаболизма или неравномерного потребления отдельных компонентов среды.

Например, при потреблении углеводов в среде накапливаются органические кислоты, снижающие величину рН среды. В средах с KNО3, как уже отмечалось, показатель рН возрастает за счет более интенсивного потребления нитрат-иона и накопления ионов калия.

Чтобы не допустить чрезмерного изменения значения рН в культурах микроорганизмов и удержать его на необходимом уровне, используют различные приемы. Иногда в среды добавляют буферные растворы. В микробиологической практике чаще других применяют фосфатные буферы. Однако если рост микроорганизмов сопровождается образованием большого количества кислот, то тех количеств буферного раствора, которые можно добавлять к средам (не более 5 г фосфатов на 1 л среды), оказывается недостаточно, так как противодействие любого буфера изменению показателя рН ограничено. В связи с этим для микроорганизмов, активно изменяющих кислотность среды, применение буферов не эффективно. При культивировании таких микроорганизмов в среды вводят избыточное количество мела, который нейтрализует образующиеся кислоты. Для нейтрализации кислот по ходу развития культуры можно применять 10%-ный стерильный раствор бикарбоната натрия NaHCО3.

Поддержание определенного значения рН во время роста особенно важно для тех микроорганизмов, которые в процессе жизнедеятельности образуют кислоты, но не обладают устойчивостью к ним. К их числу относятся молочнокислые бактерии, а также многие псевдомонады.

Большие затруднения встречаются, когда нужно поддержать значение рН в слабощелочных средах, так как для диапазона рН от 7,2
до 8,5 подходящих буферов не существует. С этой целью иногда приходится периодически или непрерывно доводить показатель рН до нужной величины, добавляя стерильно в среду растворы кислоты или щелочи при постоянном контроле значения рН. В современных ферментерах это достигается с помощью специальных автоматических устройств.


3.2 Аэрация


Кислород входит в состав воды и многих соединений, поэтому поступает в клетки в больших количествах. Значительная часть микроорганизмов нуждается в постоянном притоке молекулярного кислорода. Такие микроорганизмы принято объединять в группу облигатных аэробов. Энергетическим процессом у них является аэробное дыхание, а молекулярный кислород играет роль терминального окислителя.

Среди облигатных аэробов выделяют группу микроаэрофильных микроорганизмов, которые нуждаются в кислороде, но лучше растут, если его парциальное давление меньше, чем в воздухе. Развитие других микроорганизмов, напротив, возможно только в отсутствии кислорода. Получение энергии у них не связано с использованием молекулярного кислорода, а для многих кислород даже токсичен: он угнетает рост или вызывает гибель клеток. Такие микроорганизмы называются облигатными анаэробами. Факультативные анаэробы (аэробы) способны расти как в присутствии, так и в отсутствии молекулярного кислорода. Например, некоторые дрожжи и энтеробактерии в зависимости от наличия кислорода осуществляют аэробное либо дыхание, либо брожение. Неодинаковые потребности микроорганизмов в свободном кислороде учитывают при выборе способа их выращивания.

3.2.1 Культивирование аэробных микроорганизмов

Аэробные микроорганизмы можно выращивать на поверхности жидких и плотных сред – поверхностное культивирование или внутри жидкой питательной среды – глубинное культивирование. При поверхностном культивировании кислород поступает в клетки микроорганизмов непосредственно из воздуха, поэтому важно увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом. Для этого среды наливают тонким слоем в посуду с широким дном чашки Петри, колбы Виноградского, матрасы.

Растущие в жидких средах аэробные микроорганизмы часто образуют на поверхности пленку. Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение. Поверхностное культивирование применяется как в лабораторных условиях, так и в промышленности.

Все способы глубинного культивирования аэробных микроорганизмов сводятся к увеличению поверхности соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха. Следует иметь в виду, что при глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный кислород. Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать.

При аэрации среды учитывают два показателя: интенсивность и степень аэрации. Интенсивность аэрации характеризуется скоростью растворения кислорода в единице объема культуральной жидкости за единицу времени. Степень аэрации – это объем воздуха, продуваемый через определенный объем среды за единицу времени.

Наиболее простой и широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования – выращивание на качалках, обеспечивающих встряхивание или вращение колб и пробирок со скоростью от 100 до 200 об/мин и более. Чем больше частота вращения, тем больше соприкосновение среды с воздухом и выше насыщение ее кислородом. Увеличить аэрацию среды при работе на одной и той же качалке можно за счет уменьшения объема среды или применения колб с отбойниками – вдавливаниями стекла внутрь в виде 4–8 отростков длиной от 2 до 3 см. При вращении колб с отбойниками поверхность соприкосновения среды с воздухом заметно увеличивается благодаря разбрызгиванию жидкости. Чем больше отбойников, тем сильнее разбрызгивание жидкости, тем выше аэрация.

Интенсивность аэрации при выращивании микроорганизмов на качалке косвенно характеризуют сульфитным числом. В основе метода лежит определение скорости окисления сульфита в сульфат в присутствии меди как катализатора.

Сульфит, оставшийся неокисленным, связывают йодом. Количество йода, не вступившего в реакцию с сульфитом, оттитровывают тиосульфатом. Таким образом выясняют, сколько сульфита в определенном объеме его раствора за определенное время окисляется кислородом воздуха. Метод дает лишь сравнительные данные о скорости поглощения кислорода раствором сульфита в условиях аэрации, аналогичных опытным.

Для аэрации культуры микроорганизмов помимо перемешивания можно применять продувание стерильного воздуха через толщу среды. Этот способ часто используют в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии при получении биомассы и различных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов – антибиотиков, ферментов, кислот. Скорость потока воздуха через среду необходимо контролировать. Для этого используют различные приборы – газовые часы, ратометры и др. В ферментерах количество пропускаемого воздуха поддерживают на заданном уровне автоматически. Воздух стерилизуют путем пропускания через активированный древесный уголь, стеклянную вату, пропитанную антисептиком, или специальные ткани из полимеров. В лабораторных опытах, когда объем и скорость поступления воздуха невелики, используют заранее простерилизованные ватные фильтры. Для возможно более сильного распыления воздух пропускают через мелкопористые пластинки барботеры; в лабораторных опытах с этой целью применяют стеклянные фильтры. Для аэрации культур микроорганизмов, как правило, используют обычный воздух.




1 – вход воздуха; 2 – выход воздуха; 3 – барботер; 4 – отбойники;

5 – мешалка


Рисунок 5 – Схема ферментера для глубинного культивирования аэробных микроорганизмов

Продувание сред кислородом в лабораторных условиях не рекомендуется, так как чрезмерное насыщение среды кислородом (до
40 мг/л) может привести к угнетению роста микроорганизмов. В ферментерах принудительную аэрацию обычно совмещают с механическим перемешиванием среды мешалками, скорость вращения которых может достигать сотен и даже тысяч оборотов в минуту. Схема ферментера для глубинного культивирования аэробных микроорганизмов приведена на рисунке 5.

3.2.2 Культивирование анаэробных микроорганизмов

Культивирование анаэробов более сложный процесс, чем культивирование аэробов, так как соприкосновение клеток анаэробов с кислородом воздуха должно быть сведено к минимуму или даже полностью исключено. Для этого используют разные приемы, нередко комбинируя их друг с другом.

Выращивание в высоком слое среды — наиболее простой способ ограничения доступа воздуха к клеткам микроорганизмов. Жидкую среду наливают в сосуды для культивирования высоким слоем. Поскольку нельзя стерилизовать среды, если они занимают более половины высоты сосуда, часть среды стерилизуют отдельно и стерильно доливают ею сосуд для культивирования сразу после посева.

Непосредственно перед посевом среду кипятят или прогревают на кипящей водяной бане от 30 до 40 мин, затем быстро охлаждают, чтобы в ней не успел раствориться кислород воздуха, и вносят на дно посевной материал.

Иногда используют метод культивирования в вязких средах. Диффузия кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости, поэтому в вязких средах, таких как картофельная или среды с кукурузной либо другой мукой, хорошо развиваются некоторые облигатные анаэробы, например, возбудители маслянокислого или ацетонобутилового брожения. Вязкость сред легко увеличить добавлением к ним от 0,2 до 0,3 % агара.

Для получения изолированных колоний при выделении чистых культур или определении их численности анаэробные микроорганизмы выращивают в толще питательной среды. Для этого посевной материал вносят в расплавленную и остуженную до температуры 48…50°С агаризованную, желательно осветленную среду, тщательно перемешивают и оставляют в пробирках или переливают стерильной пипеткой в заранее простерилизованные трубки Бурри или чашки Петри. Поверхность среды в пробирках заливают парафином. Трубки Бурри – это стеклянные трубки длиной от 20 до 25 см, диаметром от 1,0 до 1,5 см. Трубки стерилизуют, закрыв оба конца ватными пробками. Перед посевом ватную пробку у одного конца заменяют стерильной резиновой, через другой конец трубки вносят среду с посевным материалом и закрывают также резиновой пробкой (рисунок 6). При использовании чашек Петри для выращивания анаэробов засеянную агаризованную среду наливают в крышку чашки и после того, как среда застынет, плотно прижимают к ее поверхности дно чашки. Зазор между стенками дна и крышки, где среда соприкасается с воздухом, заливают стерильным парафином (рисунок 7).



1


2

1 – трубка, подготовленная к стерилизации;2 – колонии анаэробных микроорганизмов в толще агаризованной среды


Рисунок 6 – Трубка Бурри





1 – агаризованная среда; 2 – парафин


Рисунок 7 – Культивирование анаэробов в чашке Петри


Анаэробные микроорганизмы можно выращивать в анаэростатах – вакуумных металлических камерах, снабженных манометром. Анаэростатом может служить обычный вакуумный стеклянный эксикатор. Из анаэростата откачивают воздух, а затем, как правило, заполняют его газовой смесью, состоящей из азота (90…80 %) и углекислоты (10…20 %), до давления порядка 67…103 Па (1,7 атм). Избыточное давление исключает возможность диффузии кислорода воздуха.

Некоторые строгие анаэробы, например, ацетогенные бактерии, метаногены, некоторые грибы, расщепляющие целлюлозу, микроорганизмы рубца жвачных животных, погибают даже при кратковременном контакте с кислородом воздуха. При культивировании таких микроорганизмов следует применять методы, позволяющие исключить молекулярный кислород из сред культивирования, создавать и поддерживать в них низкий окислительно-восстановительный потенциал (Eh). Степень поглощения кислорода и восстановленности среды определяется потенциалом Eh, который может быть измерен электрометрически на потенциометре или с помощью индикаторных красителей, например, резазурина, феносафранина, нейтрального красного и т.д., изменяющих окраску при изменении значения Eh. Особенно удобен резазурин, который добавляют к средам в концентрации 1 мг/л и стерилизуют вместе с минеральными компонентами среды. В окисленной форме он окрашен в голубой цвет, при восстановлении цвет меняется на слабо-розовый, полностью восстановленная форма бесцветна. Резазурин
изменяет окраску при значениях Eh, близких к 420 мВ, феносафранин – в области 252 мВ.

Принципы культивирования строгих анаэробов, разработанные профессором Р. Хангейтом (США), состоят в следующем:

а) все процедуры – приготовление и розлив сред, посевы, культивирование микроорганизмов и т.д. проводят с максимальной защищенностью от контакта с кислородом (анаэробный бокс, кипячение, работа в токе стерильного газа, использование герметически закрытых сосудов и т.д.);

б) до посева микроорганизмов в среды добавляют восстановители (цистеин, сульфид натрия, тиогликолат в щелочной среде) для химического поглощения следов кислорода, диффундирующего в сосуды для культивирования даже через резиновые пробки;

в) все пересевы и добавки в среды проводят с помощью шприцев, продутых газом, не содержащим кислород;

г) все трубки и шланги, используемые для пропускания газа, должны быть изготовлены из материала, не допускающего (медь) или допускающего в слабой степени диффузию сквозь него кислорода воздуха (бутилированная резина).

В качестве поглотителя кислорода из газов в лабораторной практике используют щелочные растворы пирогаллола или дитионита натрия, металлическое железо, медь, нагретую до температуры 400С, или некоторые другие реактивы. При этом необходимо учитывать поглощающую способность реактивов и объем замкнутого пространства, в котором выращивают микроорганизм. Например, на каждые 100 мл емкости используют 1 г пирогаллола и 10 мл 2,5 н. раствора гидроксида натрия. Поскольку многие анаэробы нуждаются в углекислоте, пирогаллол часто растворяют не в щелочи, а в насыщенном растворе бикарбоната натрия. Полноту поглощения кислорода контролируют раствором, содержащим окислительно-восстановительный индикатор. Для приготовления раствора смешивают равные объемы 0,024%-го NaOH, 0,015%-го водного метиленового синего и 6%-й глюкозы; в качестве антисептика к раствору добавляют тимол. Перед использованием в пробирку наливают 5 мл смеси и нагревают на кипящей водяной бане до обесцвечивания, быстро охлаждают и помещают в анаэростат или анаэробный бокс. В анаэробных условиях раствор остается бесцветным.

Для удаления следов кислорода из промышленных газов, которые поставляют в баллонах, содержащих до 1,5 % воздуха, используют следующую процедуру: газ пропускают через стеклянную трубку, заполненную медными стружками и нагретую до температуры 400°С с помощью электронагревателя (для этой цели подойдет спираль от бытовой электроплитки с керамическими изоляторами). Обработанный таким образом газ практически не содержит кислорода, так как медь при высокой температуре эффективно связывает кислород с образованием СuО. Для регенерации меди используют газообразный водород: СuО+Н2=Сu+Н2О. Такой газ необходим при заполнении переходного шлюза в анаэробном боксе.

В качестве восстановителя чаще всего используют сульфид и
тиогликолат натрия. Обычно готовят 1%-ные растворы этих восстановителей в 5%-ном растворе бикарбоната натрия, стерилизуют автоклавированием и добавляют к средам сульфид натрия из расчета
250…500 мг/л, а тиогликолат – до 250 мг/л среды. Восстановители используют в концентрациях, не влияющих на рост микроорганизмов.

Работа со строгими анаэробами представляет большие трудности и требует специального оборудования.